# 免疫必考
1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能。
2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。
3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织
4、B细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg
表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体。
成熟B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22 （成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD）同时检测CD5分子，可分为B1细胞和B2细胞。
B细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。
5、T细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是CD3（多链糖蛋白）；辅助T细胞的标志是CD4；杀伤T细胞的标志是CD8；T细胞受体=TCR。
T细胞和NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）；
CD3＋CD4＋CD8－ = 辅助性T细胞（Th）CD3＋CD4－CD8＋ = 细胞毒性T细胞（Tc或CTL）（T细胞介导的细胞毒试验）CD4＋CD25＋ = 调节性T细胞（Tr或Treg）
T细胞功能检测：植物血凝素（PHA）刀豆素（CONA）刺激T细胞增殖。增殖试验有：形态法、核素法。
T细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法
*E花环试验是通过检测SRBC受体而对T细胞进行计数的一种试验；
6、NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞）
表面标志：CD16（ADCC）、CD56。
测定人NK细胞活性的靶细胞多用K562细胞株，而测定小鼠NK细胞活性则常采用YAC-1细胞株。
7、吞噬细胞包括：单核-吞噬细胞系统（MPS，表面标志CD14，包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。（表达MHCⅡ类分子）
8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。
9、免疫球蛋白可分为分泌型（sIg，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（mIg，作受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白）
10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序）免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。
11、免疫球蛋白的同web 种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL）
12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和VL（高变区）是抗原结合部位。
13、IgG：血清中含量最高的免疫球蛋白（IgG1最高），血液和细胞外液中的主要抗体。也是再次免疫应答的主要抗体，是唯一能通过胎盘的抗体，大多数抗菌抗体、抗病毒抗体是IgG，某些自身抗体及超敏Ⅱ型抗体是IgG，免疫学检测中第二抗体也以IgG为主。
14、IgA：分血清型（单体存在）及分泌型；分泌型IgA（sIgA）为二聚体，性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，局部浓度高，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。
15、IgM：为五聚体，主要存在于血液中，是Ig中分子量最大的（又称巨球蛋白）。个体发育最早合成和分泌的抗体。抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染。新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。
16、IgE：为单体结构，正常人血清中含量最低。IgE为亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应。特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。
17、补体：具有酶样活性的球蛋白（肝细胞、巨噬细胞产生）；激活途径主要有三种：经典途径（以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂（双链DNA），C1～C9全部参与）、替代途径（病原微生物细胞壁成分（脂多糖）直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程）、MBL途径（由急性炎症期产生的甘露糖结合凝集素（MBL）与病原体结合后启动激活）。
18、补体系统中C3含量最多，C2含量最少。
19、灭活：加热56℃30分钟，补体丧失活性
20、补体清除免疫复合物的方式：吞噬调理；免疫粘附；免疫复合物抑制。
21、完全抗原=反应原性+免疫原性。半抗原=反应原性（无免疫原性）
22、抗原抗体结合力（分子间引力）：静电吸引、范德华力、氢键、疏水作用力（最强）
23、抗原抗体反应的四大特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性；受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。
24、抗体过量——前带；抗原过量——后带（钩状效应）
25、抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。
26、颗粒性抗原出现凝集反应。可溶性抗原出现沉淀反应。单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。
27、木瓜酶水解IgG为2Fab+Fc；胃蛋白酶水解IgG为F(ab)2+nFc。
28、最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。
29、R（兔子）型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较宽，适于作诊断试剂。H（马）型抗血清是用马等大动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。
30、抗血清常见保存条件：2-8℃保存；冷冻保存（最常用）；真空干燥保存（5-10年）。
31、杂交瘤细胞放入液氮（-196℃）前，需要逐步降温。复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。
32、凝集反应分为两个阶段：①抗原抗体的特异性结合；②出现可见的颗粒凝聚。
33、直接凝集反应的原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质（0.85%氯化钠）参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。抗原=凝集原，抗体=凝集素。
34、玻片凝集试验：主要用于抗原的定性分析，AB0血型的测定。
试管凝集试验：肥达氏试验、外斐试验、输血交叉配血试验；
35、红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝反应，称为正向间接血凝反应（PHA）。红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应（RPHA）。
36、间接血凝抑制试验：可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。
37、金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）
38、血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1:64，同时设不含标本的稀释液为对照孔。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。
39、明胶凝集试验（间接）：HIV-1抗体和抗精子抗体检测
40、抗球蛋白试验，又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。包括直接Coombs试验（检测红细胞上的不完全抗体）和间接Coombs试验（游离在血清中的不完全抗体）
41、沉淀反应分两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见。第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
42、免疫比浊：最适pH为6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。
43、对流免疫电泳：抗体流向负极，抗原流向正极
44、免疫固定电泳也用予尿液中本-周蛋白的检测及κ、λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。
45、RIA（放免）核素（125Ⅰ）标记抗原，竞争抑制（标记抗原和非标记抗原竞争限量抗体）；IRMA（免疫放射）核素标记抗体，非竞争结合（过量标记抗体，反应速率比RIA快，灵敏度明显高于RIA。）
RIA可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。
46、常用的荧光素有：异硫氰酸（FITC）黄绿色，最常用；四乙基罗丹明（RB200）橘红色；四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色；藻红蛋白（R-RE）橙色。其他：铕（Eu3＋）
47、荧光标记蛋白的常用方法：搅拌法和透析法。
荧光抗体效价鉴定：抗原含量为1g／L时，抗体效价＞1：16
48、时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）以镧系元素（如：铕）化合物为荧光标记物。
49、偏振免疫测定的偏振波长是485nm（蓝光）。
50、辣根过氧化物酶（HRP）：底物（1）邻苯二胺（OPD），（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。
碱性磷酸酶（ALP）：底物：对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）
β-半乳糖苷酶（β-Gal）：底物：4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU）
51、异相法：先分离，后测定；均相法：不分离，直接测。
52、酶联免疫吸附试验（ELISA）：
必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶反应的底物。
抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法（HBsAg）。只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。
抗体测定：通常使用间接法(HCV、HIV)、双抗原夹心法（HBsAb）、竞争法（HBcAb、HBeAb）和捕获法（IgM）等
*待测孔最后显示的颜色深浅与标本中的待测抗原或抗体呈正相关的是：双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体；
53、化学发光底物有：直接化学发光剂：吖啶酯和三联吡啶钌；酶促反应发光剂：（标记酶HRP）鲁米诺及其衍生物、（标记酶为碱性磷酸酶）AMPPD；
54、免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。
55、外周血单个核细胞的分离的分层液常用：Ficoll（由上到下为血浆，单个核细胞，粒，红）和Percoll（由上至下：死细胞，单个核细胞，淋，红，粒）。
56、纯淋巴细胞群的采集有：黏附贴壁法，吸附柱过滤法，磁铁吸引法，Percoll分离液法。
57、T细胞和B细胞的分离：E花环沉降法，尼龙毛柱分离法
58、淋巴细胞活力测定：台盼蓝染色法，死细胞为蓝色。
59、CD4是HIV受体，HIV感染时CD4／CD8比值明显降低。
60、CD4／CD8升高常见于自身免疫性疾病；而CD4／CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。
61、（ELISA）双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法。
62、流式细胞仪：前向散射光（FS）反映颗粒的大小。侧向散射光（SS）反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光（FL）反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。
63、免疫荧光标记最常用的荧光染料：异硫氰酸荧光素（FITC）亮绿色荧光。德州红红色荧光。藻胆蛋白类橙色至红色荧光。检验星空综合整理。
64、临床上常用三色荧光抗体标记将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞确定为NK细胞。
65、AIDS患者的一个特征性免疫诊断指标表现为：T淋巴细胞总数减少，T细胞亚群CD4Th／CD8Tc比例倒置，Th／Tc＜1.0，Th细胞数量显著下降甚至测不出，而Tc细胞数量可正常或增加，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。
65、强直性脊柱炎——HLA-B27
66、SLE患者以IgG、IgA升高较多见。类风湿关节炎患者以IgM增高为主。
67、M蛋白（MP）是B淋巴细胞或浆细胞单克隆异常增殖（＞30g／L）所产生的一种在氨基酸组成及顺序上十分均一的异常单克隆免疫球蛋白。多无免疫活性，故又称副蛋白。临床上多见于多发性骨髓瘤、高丙种球蛋白血症、恶性淋巴瘤、重链病、轻链病等
68、M蛋白-最基本方法：血清蛋白区带电泳技术
M蛋白-粗筛试验：血清免疫球蛋白定量（单向琼脂免疫扩散法和免疫比浊法）
M蛋白-鉴定，首选方法：免疫固定电泳（IFE）技术（区带电泳技术与特异性抗血清的免疫沉淀反应相结合）是临床最常用的方法。
69、IgD降低见于原发性无丙种球蛋白血症、矽肺
70、CSF中的浓度：IgG＞IgA＞IgM。神经系统肿瘤时，以IgA和IgM升高为主。
（感染、血管病变、系统性疾病=IgG升高）
71、本-周蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链。尿中可测得，血中呈阴性（原因是本-周蛋白分子量小，极易迅速自肾脏排出，血中含量并不升高）
72、冷球蛋白又称冷免疫球蛋白，在-4℃时发生沉淀，于37℃时又复溶解。采血是冷球蛋白检测的关键，宜在体温条件下采集和保存静脉血。
73、补体结合试验（CFT），梅毒的诊断，华氏反应。
74、非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定法。
均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定法。
75、链球菌感染：ASO（胶乳凝集试验、免疫散射比浊法）
76、伤寒沙门菌有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面（Vi）抗原。肥达反应，效价≥1:80为阳性
77、卡氏肺孢菌，又称卡氏肺孢子虫，为类真菌。
78、Ⅰ型超敏反应：由特异性IgE抗体介导产生，其发生速度最快。（青霉素、支气管哮喘）
提高Th1细胞活性，减少IL-4的分泌，可降低IgE的产生，阻断IgE介导的Ⅰ型超敏反应。
参与Ⅰ型超敏反应：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。
79、Ⅱ型超敏反应：又称细胞毒型或细胞溶解型超敏反应，它是由靶细胞表面的抗原与相应IgG或IgM类抗体结合后，在补体（细胞溶解）、巨噬细胞（吞噬）和NK细胞（ADCC作用）参与下，引起的以细胞溶解或组织损伤为主的病理性免疫反应。（输血反应、新生儿溶血症、自身免疫性溶血性贫血、药物过敏性血细胞减少症、肺出血肾炎综合征、甲状腺功能亢进）
80、Ⅲ型超敏反应：由可溶性免疫复合物沉积于局部或全身多处毛细血管基底膜，通过激活补体，并在血小板、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞等的参与下，引起的以充血水肿、局部坏死和中性粒细胞浸润为主要特征的炎症反应和组织损伤。（Arthus反应、类Arthus反应、血清病、链球菌感染后肾小球肾炎、类风湿关节炎、SLE）/81、Ⅳ型超敏反应：又称迟发型超敏反应（DTH），是效应T细胞与特异性抗原结合后，引起的以单个核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应。（细胞免疫）效应性CD4+Th1细胞识别抗原后活化，可释放IFN-γ、TNF、淋巴毒素（LT）、IL-3、GM-CSF、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等多种细胞因子。
常见Ⅳ型超敏反应性疾病：感染性迟发型超敏反应（结核分枝杆菌、病毒、原虫）、接触性皮炎、移植排斥反应。（结核菌素皮试、斑贴试验）
82、变性的IgG可刺激机体产生抗变性IgG抗体（类风湿因子）
83、ITP患者血清中存在有抗血小板抗体，该抗体可以缩短血小板的寿命。
84、抗乙酰胆碱受体抗体：对重症肌无力（MG）具有诊断意义。
85、毒性弥漫性甲状腺肿患者血清中有抗促甲状腺激素受体（TSHR）的IgG型自身抗体。（甲状腺功能的亢进）
86、多发性肌炎是以损害肌肉为主要表现的自身免疫性疾病，如果同时有皮肤损害，则称为皮肌炎。
87、75%的PSS患者有抗核抗体阳性，抗Scl-70抗体是PSS的特异性抗体，80%～95%的局限性硬皮病患者抗着丝点抗体阳性。
88、自身免疫病（AID）的特征：高滴度自身抗体，病理特点为免疫炎症损伤与抗原分布一致，能建动物模型。
89、抗DNP抗体（抗核蛋白抗体）通常完全被DNA和组蛋白吸收，是形成狼疮细胞的因子。
90、ANA阳性的荧光现象分：核膜型、均质型、斑点型、核仁型。ANA常为自身免疫病的初筛试验。
91、ENA是可提取核抗原的总称，分子中不含DNA。
92、抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性。抗Sm抗体也是SLE的特异性标志之一。此两项常为SLE确诊指标。（对疑为SLE的患者，应先进行ANA和抗dsDNA抗体的检测，当ANA和（或）抗dsDNA抗体阳性时，再作抗ENA抗体谱的检测。如有抗Sm抗体和（或）抗RNP抗体阳性，可实验室诊断为SLE）
93、抗核RNP抗体：为MCTD（混合性结缔组织病）的诊断指标。
94、抗SSA/抗SSB抗体：为干燥综合征（SS）的诊断指标。（当ANA阳性而抗dsDNA抗体阴性，抗ENA抗体谱中抗SsA抗体和（或）抗ssB抗体阳性，可实验室诊断为干燥综合征。）
95、抗Jo-1抗体：多发性肌炎（PM）患者常为阳性。
96、抗Scl-70抗体：进行性系统性硬皮症（PSS）的诊断指标。
97、NCA：原发性小血管炎的特异性血清标志物
98、内风湿性关节炎（RA）：自身抗体有RF、抗角蛋白抗体（AKA）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）。
99、Farr法测定dsDNA抗体的特异性高，为公认标准法，当抗dsDNA抗体结合率大于20%时对SLE有意义。
100、抗线粒体抗体（AMA）：原发性胆汁性肝硬化
101、巨球蛋白血症：以分泌IgM的浆细胞恶性增殖为病理基础的疾病。好发于老年男性，主要表现骨髓外浸润，以肝、脾和淋巴结肿大为主要体征并伴有血黏滞过高综合征，如表现为视网膜出血。（血清呈胶冻状难以分离，电泳时血清有时难以泳动，集中于原点是该病的电泳特征）
102、异常免疫球蛋白检测的应用原则
初筛实验：区带电泳分析、免疫球蛋白定量检测和尿本-周蛋白定性检测。
确证实验：免疫电泳、免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型、血清及尿中轻链蛋白的定量检测。
103、HIV诱导的免疫应答1.体液免疫应答 HIV感染后，机体可产生：中和抗体、抗P24壳蛋白抗体、抗gp120和抗gp41抗体2.细胞免疫应答：CD8+T细胞应答、CD4+T细胞应答。
104、HIV抗原检测：核心抗原p24（ELISA）
105、免疫印迹法判断标准为：
①HIV抗体阳性：至少有两条膜带（gp41／gp120／gp160）或至少一条膜带与p24带同时出现；
②HIV抗体阴性：无HIV抗体特异性条带出现；
③HIV抗体可疑：出现HIV特异性条带，但带型不足以确认阳性者。
CD4+T细胞计数是反映HIV感染患者免疫系统损害状态的最明确指标。当CD4+T细胞低于500／μl，则易机会性感染；低于200／μl，则发生AIDS。
106、CEA大于60μg/L时可见于结肠、胃、肺癌。手术6周后CEA水平正常。
107、AFP——原发性肝癌。PSA——前列腺癌
108、糖类抗原有：CA125：上皮性卵巢癌和子宫内膜癌；CA15-3：乳腺癌；CA19-9：胰腺癌、结直肠癌。
109、神经母细胞瘤和小细胞肺癌（基因有P53，RB）的标志物：神经元特异性烯醇化酶（NSE）
110、排斥反应有：宿主抗移植反应（HVGR）和移植物抗宿主反应（GVHR）。
111、移植物存活与HLA配型的关系是：
①供、受者HLA-A和HLA-B相配的位点数越多，移植物存活几率越高；
②供、受者HLA-DR位点相配更重要，因为HLA-DR和HLA-DQ基因有很强的连锁不平衡，DR位点相配的个体，通常DQ位点也相配；
③不同地区HLA匹配程度与移植结果的关系有着不同的预测价值。
112、免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~
基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。
（一）小鼠骨髓瘤细胞
理想骨髓瘤细胞的条件：①细胞株稳定，易于传代培养；②细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；③该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；⑤融合率高。
目前最常用的是NS-1和SP2/O细胞株
（二）免疫脾细胞
多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。
（三）细胞融合
是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作细胞融合剂，浓度30~50 %之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养
肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本 细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。
| 细胞类型 | 正常培养细胞 | TK缺陷细胞 | HGPRT缺陷细胞 | 杂交瘤细胞 |
|---|---|---|---|---|
| 正常培养基 | |
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| HAT培养基 | |
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（agglutinationreaction）是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
①直接~：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，称为~。
②间接~：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象，称为~。其敏感度高于直接凝集反应和沉淀反应。
正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体。
反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原。
间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。
间接血凝试验：是以红细胞为载体的间接凝集试验，即用已知的抗原（或抗体）致敏红细胞，与标本中相应的抗体（或抗原）特异结合，出现红细胞凝集现象。
胶乳凝集抑制试验（LAT）：将抗原（或抗体）致敏胶乳颗粒，直接与待检标本中的抗体（或抗原）发生凝集反应。（常用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳）
直接coombs试验：将抗人球蛋白试剂直接加到表面结合抗体的受检红细胞中，即可见细胞凝集。用于检测吸附于红细胞表面的不完全抗体。（如HDN、AIHA）
间接coombs试验：将受检血清和具有相应抗原性的红细胞相结合，再加入抗人球蛋白抗体即可出现可见的红细胞凝集。用于检测血清中游离的不完全抗体。
（precipitationreaction）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。
钩状效应（high dose hook effect）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。
单向免疫扩散实验：是先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。环的直径或面积的大小与抗原含量正相关。常用于IgG/A/M、补体 C3/C4等血浆蛋白的测定。
双向免疫扩散试验：是将抗原核抗体加在同一琼脂板的对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线。①沉淀线靠近抗原孔，说明抗体浓度较大；靠近抗体孔则说明抗原浓度大。②形成的沉淀线弯向分子量大的一方。③（待测物为两种抗原）两条沉淀线互相吻合相连，两抗原中存在相同表位；两条沉淀线交叉，说明两抗原完全不同；两条沉淀线相切，提示两抗原之间有部分相同。
对流免疫电泳（CIEP）：实质上是双扩和电泳的结合。在pH8.6的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，分子量小、等电点低、带有较多负电荷的Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6--7），在pH8.6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线。（抗原加在-级，抗体加在+级）
抗原浓度越高，沉淀线越接近抗体孔，甚至超过抗体孔。本法简便快速，灵敏度是双扩的8~16倍，可检出蛋白质浓度达μg/ml，常用于Ag/Ab的性质/效价/纯度测定。
火箭免疫电泳（RIE）：实质上是单扩和电泳的结合。是将抗体混合于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极移动，并随抗原浓度的下降，抗原泳动的基底区也逐渐变窄，抗原抗体免疫复合物形成的沉淀西安也越来越窄，形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。
抗体浓度一定时，沉淀峰的高度与抗原量呈正相关。其灵敏度可达ng/ml，常用于IgA/G等蛋白定量。
免疫电泳（IEP）：将待测标本（蛋白质抗原）置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因所带电荷、分子量及构型不同，被分成肉眼不可见的若干区带。然后沿与电泳方向开一平行的抗体槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。18-24h后，各区带蛋白与相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。
免疫固定电泳（IFE）：实质是区带电泳和沉淀反应相结合。先将血清蛋白质置于琼脂凝胶中进行区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面的泳道上，经过孵育，固定剂和抗血清在凝胶内渗透、扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的抗体，形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中。经氨基黑，参考泳道和抗原抗体沉淀区被着色，根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类Ig及其轻链进行分型。最常用于M蛋白的鉴定。
放射性核素：具有放射性的核素，在自然条件下可发生自发性的转化变为另一种（放射性）核素，并同时释放射线。这一转变过程称为放射性衰变。
放射化学纯度：指在标记物中结合在抗原（或抗体）上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比。
比放射活性：是指单位质量标记物中所含的放射性活度，或每分子抗原（或抗体）平均所结合的放射性原子数目。
放射免疫分析（RIA）：是利用放射性核素标记抗原与非标记抗原（待测/标准抗原）同时和限量特异性抗体进行竞争性结合反应，通过测定放射性核素标记抗原与抗体复合物的放射性活度，经相应的数学函数关系推算待测抗原的含量。
免疫放射分析（IRMA）：是利用放射性标记的抗体来测定样品中抗原的方法，所用的标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。待测抗原与过量标记抗体结合反应形成标记抗体-抗原复合物及游离的标记抗体，测定的是标记抗体-抗原复合物的量.
荧光免疫技术：是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫荧光技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。
荧光抗体技术（FAT）：以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色，并借助荧光显微镜观察标本片上荧光染色的形态，从而判断是否存在待测抗原，这种技术就是~。
荧光抗体染色方法：直接法（简便快速特异性强，但敏感性不如间接法，一种荧光抗体只能检测一种抗原）、间接法（敏感性比直接法高5~10倍，一种荧光二抗可检测多种抗原/抗体，但容易产生非特异性荧光）、双标记法（用于检测同一标本中的两种抗原）
荧光：荧光物质吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为~。
①发射光谱：是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的谱图
②激发光谱：是指固定检测发射光（荧光）波长，用不同波长的激发光照射样品得到的荧光的谱图。
③荧光效率：是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。
④荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
⑤荧光猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。
只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素。
（TRFIA）：是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。它具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等优点，已在临床检测中广泛使用。
【基本原理】
1、时间分辨：通常各种组织、蛋白或其他化合物，在激发光照射下都能发出一定波长的自发荧光，这些荧光是非特异性的，会干扰荧光免疫测定，影响其特异性和灵敏度，但它们的荧光寿命常较短（1~10 ns），最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10~1000 μs），因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。
这是本技术具有高灵敏度的原因之一。
2、stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（通常为273nm），激发/发射光谱不重叠，用简单的滤光片就能把激发光和发射光分开，可消除激发光散射引起的干扰。
3、发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±10nm，利用615nm±5nm的滤光片只允许此波段的发射光通过，可排除其余波长的荧光。生物样品的本底荧光波长通常在350~600 nm，故在615nm±5nm波段内，来自生物样品的荧光干扰极少，可有效降低本底荧光。
镧系元素的激发光谱则较宽，通常为300~350 nm，非常有利于增加激发能，提高检测的灵敏度。
4、荧光标记物的相对比活性：测定Eu3+螯合物发射荧光采用的激发光源为脉冲氙灯，其工作频率为1000次/秒，由光导纤维闪光管的控制系统。
比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。在测量时间内，Eu3+可被反复激发，每次激发后，他可很快由激发态回到基态，发射荧光；然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，这就大大提高了荧光标记物的比活性。
5、信号增强：免疫反应完成后，形成Eu3+标记的抗原抗体复合物，其在弱碱性溶液中的激发荧光信号较弱，加入酸性增强液可使Eu3+标记的抗原抗体复合物的pH降至2~3，Eu3+从复合物上完全解离，游离的Eu3+可被增强液中的螯合剂所螯合，在协同剂等成分的作用下，与增强液中的β-二酮体生成以Eu3+为核心的保护性胶态分子团，它是具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。
（二）标记物和标记方法
1、标记物：用于本技术测定的标记物是镧系元素，其中铕（Eu3+）和铽（Tb3+）的荧光寿命特别长且荧光强度高，多用这两元素作为标记物，其中Eu3+最为常用。
镧系元素在游离状态下的荧光相对较弱，与螯合剂如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）等形成螯合物后，可使荧光强度增强。螯合物的荧光寿命与配体有关。
2、标记方法：需利用具有双功能基团的螯合剂，一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。常用的双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等，此法可允许每个蛋白质分子上标记多个Eu3+而不影响其生物学活性和稳定性。
螯合剂可先螯合Eu3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合Eu3+（两步法）。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子蛋白载体（牛血清白蛋白，多聚赖氨酸等）连接，再标记Eu3+。
（三）方法类型
1、双抗体夹心法：将待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体 - 待测抗原 - Eu3+标记抗体 复合物，在酸性增强液的作用下，复合物中的Eu3+从免疫复合物上解离并形成螯合物，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原的含量。
2、固相抗体竞争法：将待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所得荧光强度与待检抗原含量负相关。
3、固相抗原竞争法：与固相抗体竞争法类似，只是第一步改成将待检抗原和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体。
（四）方法评价
1、优点：灵敏度高，检出下限为10^-18mol/L（普通荧光免疫计数仅为10^-8mol/L）。分析范围宽，可达4~5个数量级。标记结合物稳定，有效使用期长。测量快速，易于自动化。
本法在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面均可与RIA相媲美，是超微量物质分析方法中最有发展前途的一项技术。
2、缺点：易受环境、试剂和容器中镧系元素离子的污染，使检测本底增高。
酶免疫技术：是将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术。
是将酶与抗原或抗体结合成酶标记结合物（酶标抗原/抗体），酶标结合物既保留了抗原/抗体的免疫学活性，同时也保留了酶对底物的催化活性。在酶标记抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶作用的相应底物，通过酶催化底物产生显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定。
常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）
常用的底物：HRP有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）。ALP为对-硝基苯磷酸酯（p-NPP）。β-Gal为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）
常用的标记方法：交联法（戊二醛~）和直接法（改良过碘酸钠法）
固相载体的选择：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜载体
包被（coating）：将抗体或抗原结合在固相载体上的过程。
封闭（blocking）：用1%~5%的牛血清蛋白或5%~20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附的干扰。
【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
（一）ELISA检测抗原的方法主要有：
1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原决定簇（AD）的Ag。
先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体，加入待测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗体抗原复合物，洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育，使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体 复合物，为“双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体。加入底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。
临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg、甲胎蛋白AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG等项目的检测。
2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原决定簇，
分别制备两种单克隆抗体，在包被时使用一种单抗，酶标记时使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标记抗体同时加入反应体系，两种抗体分别与不同的抗原决定簇结合，只进行一次温育，在洗涤后即可加底物进行显色反应。担当待测抗原浓度过高时，可出现钩状效应，甚至出现假阴性结果，必要时可将标本适当稀释后重新测定。）
3、竞争法：适用于小分子Ag或半抗原（只有一个AD）。
先用特异性抗体包被固相载体，然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原，待测样本中的抗原与酶标记抗原竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合，温育一段时间后洗涤，加入底物显色。
（二）ELISA检测抗体的方法主要有：
1、间接法：检测Ab最常用的方法。
常用酶标记羊抗人IgG。
2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法，
原理类似双抗体夹心法，操作步骤也基本相同，也可采用一步法，但一般不会出现钩状效应。
临床上乙型肝炎表面抗体HBsAb的测定常用此法。
3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质，不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳定时，可采用此方法。主要用于测定HBcAb和HBeAb。原理见下：
（1）HBcAb的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原，，然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体，此时待测标本中的HBcAb与酶标记HBcAb竞争性地与固相载体上的核心抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBcAb的含量负相关。
（2）HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的HBeAb和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg，温育后洗涤，加入酶标记的HBeAb，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温育后洗涤，加入底物显色，显色强弱与待测标本中HBeAb的含量呈负相关。
4、捕获法：又称反向间接法，主要用于血清中特定Ig类别的测定，最常用于病原体急性感染诊断中IgM型抗体检测。
原理：首先将针对IgM的第二抗体包被于固相载体形成固相抗体，加入待测标本后，标本中所有的IgM（特异/非特异）即可被固相抗体捕获。第二步加入特异性抗原，其与固相载体上捕获的IgM特异性抗体结合，再加入针对特异性抗原的酶标记抗体，形成 固相抗人μ链IgM-抗原-酶标记抗体 复合物，最后加入底物显色，即可对待测标本中抗原特异性IgM进行定性或定量测定。
此法临床上常用于病原体急性感染的实验室诊断，如急性甲肝时可检测HAV-IgM抗体，急性乙型肝炎时可检测抗HBc-IgM抗体。
是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。兼有高灵敏性和高特异性。
发光：分子/原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并施放光子的过程。
化学发光：伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。
发光效率：又称化学发光反应量子产率，是指发光剂在反应中的发光分子数与参加反应的分子数之比，取决于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。
化学发光免疫技术可分为均相反应（不需分离）和非均相反应（需要分离）
非均相分离方式有：固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离。
【化学发光剂】
直接化学发光剂：鲁米诺和吖啶酯（常用）
间接化学发光剂：鲁米诺及其衍生物、AMPPD、酞菁/二甲基噻吩衍生物/Eu螯合物
【标记技术】
常用标记方法：碳二亚胺缩合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法
影响标记的因素：发光剂的选择、被标记蛋白质的性质、标记方法的选择、原料比、标记率、温度、纯化与保存。